Het overgangsseizoen naar het nieuwe millennium is uitermate goed te noemen. Fred Rutten volgt al na drie wedstrijden Hans Meyer op, die in de Bundesliga aan de slag gaat bij Borussia Mönchengladbach. Onder de nieuwe trainer Rutten wordt aanvallend en attractief voetbal gespeeld met ondermeer DE targetman Vennegoor of Hesselink. De ploeg dingt zelfs lange tijd mee naar plaatsing voor de Champions League, maar vier opeenvolgende nederlagen in de april 2000 doet de ploeg afglijden. Op de laatste speeldag kan FC Twente nog Europees voetbal veiligstellen, maar op die dag is eigenlijk niemand in Twente en omstreken met het hoofd bij voetbal. De dag voor de laatste competitiewedstrijd tegen Feyenoord in Rotterdam treft de grote vuurwerkramp Enschede. De verschrikkelijke gebeurtenis dompelt de regio in rouw, maar desondanks wordt er een dag later ‘gewoon’ gevoetbald. De KNVB eist van de Tukkers dat er wordt gespeeld. De wedstrijd eindigt in een 1-1 gelijkspel, waardoor FC Twente op een haar na Europees voetbal misloopt. Maar er is niemand die daar om maalt op dat moment.

Het seizoen 2000-2001 gaat als één van de meest gedenkwaardige seizoenen de geschiedenisboeken in. In de competitie hobbelt de ploeg naar een kleurloze klassering in de middenmoot, maar in het bekertoernooi tapt de Enschedese ploeg uit een ander vaatje. FC Twente rolt niet geheel zonder fortuin door het toernooi en treft in de halve finale Vitesse. In Arnhem bereikt de spannende wedstrijd de climax in de penaltyserie. In de zenuwslopende reeks blijkt FC Twente de beste, nadat Sjaak Polak de beslissende strafschop binnenschiet. FC Twente mag 24 jaar na de eerste hoofdprijs een poging wagen om de tweede in de wacht te slepen. In de Kuip gevuld met 35.000 aanhangers uit Enschede en omstreken neemt FC Twente het op tegen het hoogfavoriete PSV. De spannende doelpuntloze finale leidt tot wederom een strafschoppenserie. Wanneer Twente op een 1-3 achterstand komt na missers van Heubach en Vennegoor of Hesselink, lijkt de wedstrijd beslist. Maar dan geschiedt het wonder van Rotterdam: keeper Sander Boschker pakt drie strafschoppen op rij en FC Twente wint de Amstel Cup. Enschede viert dagenlang uitbundig feest en de stad verkeert in een roes van geluk.

Helaas kan de ploeg uit Enschede het bekersucces geen vervolg geven in de seizoenen 2001-2002 en 2002-2003. Onder leiding van de trainers John van ‘t Schip (2001-2002) en René Vandereycken (2002-2003) draait FC Twente twee seizoenen kleurloos mee in de competitie. Buiten het veld heeft FC Twente een rumoerige lente 2003. De club uit Enschede heeft, evenals vele andere clubs, financiële problemen en de Stichting FC Twente ’65 wordt zelfs korte tijd failliet verklaard. Nadat de stichting echter overeenstemming weet te bereiken met de belastingdienst, wordt het faillissement begin juni 2003 weer opgeheven.

De jaren na het faillissement benut FC Twente om de eigen organisatie gedetailleerd onder de loep te nemen en waar nodig maatregelen te nemen om financieel weer een gezonde club te worden. Sportieve aspiraties zijn er nauwelijks; de verwachtingen zijn dan ook niet hooggespannen. Toch voetbalt de ploeg met vele nieuwe gezichten steeds beter. Vlak voor de winterstop in het seizoen 2003/2004 ontpopt de club zich als reuzendoder door onder leiding van Blaise Nkufo zowel Ajax als Feyenoord over de knie te leggen.

In het Amstel Cup toernooi werkt de club ware thrillers af: na bloedstollende wedstrijden tegen onder meer Cambuur Leeuwarden, Feyenoord en NAC Breda mag FC Twente op 23 mei 2004 opnieuw een finale om de Amstel Cup spelen. Helaas blijkt FC Utrecht in een teleurstellende wedstrijd met 0-1 te sterk. Toch kan FC Twente met een goed gevoel seizoen 2004-2005 ingaan in de wetenschap dat de club met een jonge vernieuwde selectie veel toekomst lijkt te hebben. Onder de nieuwe trainer Rini Coolen begint FC Twente matig aan het seizoen, mede door de beperkte financiële ruimte voor versterkingen. Wanneer gedurende het eerste half jaar op creatieve wijze nieuwe spelers worden aangetrokken, beleeft het team een fantastische tweede seizoenshelft. Toch is het net niet genoeg voor Europees voetbal en de club eindigt op een zesde plek in de competitie. Desondanks mag er met vertrouwen naar de toekomst worden gekeken. Het renovatieplan ligt op schema, de schulden worden langzaam maar zeker ingelost en de vraag naar kaarten voor de wedstrijden overstijgt ruimschoots het aanbod. Niet voor niks heeft FC Twente concrete plannen het stadion uit te breiden.

In het seizoen 2008-2009 wordt door FC Twente de uitgebreide Grolsch Veste in gebruik genomen. Na twee succesvolle seizoen onder Trainer/Coach Fred Rutten, debuteert FC Twente in dit seizoen in de Champions League. Onder Rutten werden de play-offs bereikt en na eerst NAC te hebben uitgeschakeld, is op zondag 18 mei in de Amsterdam ArenA een 0-0 gelijkspel voldoende om de ticket voor de voorronde van de Champions League te bemachtigen. Op de Oude Markt in Enschede zijn 20.000 supporters aanwezig bij de huldiging van de selectie. Na twee mooie jaren, met goed en attractief voetbal, neemt Fred Rutten afscheid met deze mooie prijs. De oefenmeester vertrekt naar Schalke 04 en wordt opgevolgd door Steve McClaren. De voormalig bondscoach van het Engelse elftal zet in de eerste maanden een goede reeks neer. Nadat de Tukkers in de voorronde van de Champions League een maatje te klein waren voor Arsenal, plaatst FC Twente zich in oktober 2008 voor de poulefase van de UEFA Cup.

In de Eredivisie zetten de Tukkers de stijgende lijn voort en op de één na laatste speeldag van seizoen ‘08/’09 wint FC Twente met 3-0 van landskampioen AZ, zodat het op de tweede plaats in de Eredivisie eindigt.

In mei 2009 bereiken de Tukkers de bekerfinale waarin tegen sc Heerenveen na een 2-2 gelijkspel strafschoppen genomen moeten worden. Een zenuwslopende serie eindigt uiteindelijk in winst voor de Friezen en FC Twente ziet wederom de beker aan haar neus voorbijgaan. Ook in het seizoen ‘09/’10 mag FC Twente deelnemen aan de race om de KNVB beker, maar strandt in die strijd in de halve finale, die met 2-1 verloren wordt van Feyenoord.

In seizoen ‘09/’10 doet FC Twente mee aan de voorronde van de Champions League. Daar weten de Tukkers twee keer gelijk te spelen tegen Sporting Club de Lissabon, maar door het doelpunt van Lissabon in de laatste secondes van de wedstrijd in Enschede moet FC Twente een niveau lager verder in de Europa League. Hierin weet FC Twente te overwinteren en komt de groepsfase goed door. In de knock-out fase blijkt Werder Bremen echter te sterk en is het Europees voetbal voor FC Twente dit seizoen voorbij.

Maar toch wordt het seizoen ‘09/’10 het meest gedenkwaardige seizoen uit de geschiedenis van de club: Op zondag 2 mei 2010 wordt FC Twente voor het eerst in de geschiedenis van de club kampioen van Nederland. Met een totaal van 86 punten weet FC Twente concurrent Ajax met 1 punt verschil achter zich te laten. Tienduizenden fans kijken de wedstrijd (uit bij NAC Breda) op grote schermen in de stad of op het megascherm in De Grolsch Veste. Na de 0-2 winst breekt er een waar volksfeest los en wordt de snelweg voor even eigendom van de supporters van FC Twente om de spelers een onvergetelijk onthaal te geven. De spelers worden de maandag na de wedstrijd ontvangen in het stadhuis van Enschede en er vindt een grootse huldiging plaats bij de Grolsch Veste, waar ongeveer 70.000 mensen op af komen. De droom van velen is uitgekomen: FC Twente haalt de schaal naar Enschede.